有了這個突破之後,後面的工作順暢了很多。
他用同樣的方法繼續進行溶瘤病毒的定向培養,每一批次的元力催生都讓病毒的效能往上提升一截。
經過將近兩個月的反覆最佳化,他得到了一株效能極其優異的溶瘤病毒株,感染效率高、特異性強、裂解能力出眾,在體外實驗中能把靶向的癌細胞在四十八小時內全部裂解乾淨。
接下來是基因編輯工具的搭載。
CRISPR-Cas9是目前最成熟的基因編輯系統之一。
李斌設計了一套靶向TERT基因的sgRNA,配合高保真的Cas9蛋白,組裝成完整的基因編輯載體。
他把這套編輯系統透過慢病毒載體搭載到之前最佳化的溶瘤病毒上,形成了一個複合結構,外殼是溶瘤病毒,內部攜帶了基因編輯工具。
搭載過程比預想的順利。
可能跟元力催生過溶瘤病毒的某種“適應性”有關。
那些經過元力浸潤的病毒對外源基因片段的裝載效率非常高,幾乎不需要額外的篩選就能獲得高表達量。
李斌用了一週多的時間完成了載體構建和驗證,透過測序確認編輯系統正確整合到了病毒基因組中。
五月中旬,完整的複合型溶瘤病毒誕生了。
李斌給它編號LV-GE-01,溶瘤病毒-基因編輯-第一代。
但他心裡清楚,真正讓LV-GE-01與眾不同的那個因素,永遠不會出現在任何論文裡。
接下來是驗證實驗。
他用了六種不同來源的癌細胞系做體外測試,肺癌、肝癌、乳腺癌、結直腸癌、胰臟癌、黑色素瘤。
每種癌細胞系都設定了對照組和實驗組,對照組不加病毒,實驗組以不同的感染複數加入LV-GE-01。
然後他跟蹤了細胞的增殖曲線、端粒長度變化、TERT基因的表達水平、細胞凋亡率等多個指標。
結果幾乎是教科書級別的完美。
實驗組的癌細胞在感染LV-GE-01之後,先是出現明顯的增殖停滯,然後開始大量凋亡。
端粒長度檢測顯示,那些存活下來的少數細胞也出現了端粒的顯著縮短,而且隨著分裂代數的增加端粒繼續縮短,最後全部進入衰老狀態。
TERT基因的表達水平檢測證實了基因編輯的成功,編輯效率超過百分之九十九,殘餘的TERT表達也被大幅抑制。
六種癌細胞系,無一例外。
李斌又做了更進一步的驗證。
他把經過LV-GE-01處理後的癌細胞繼續傳代培養,觀察它們是否會出現耐藥性或者“逃逸”。
結果連續傳了二十代,那些存活下來的癌細胞始終保持著端粒縮短的狀態,沒有出現新的端粒酶啟用機制。
這意味著一件事,TERT基因的敲除是永久性的,癌細胞失去了重新啟用端粒酶的能力。
復發的基礎被徹底剷除了。
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